NanocoulterⅠ納米庫爾特單顆粒分析儀——
一種全“芯”的瑞芯細胞外囊泡檢測手段
細胞外囊泡(ExtracellularVesicles,EVs)是指從細胞膜上脫落或者由細胞分泌的雙層膜結構的囊泡狀小體，直徑從40nm到1000nm不等。智造
圖1細胞外囊泡的单颗形成過程
胞外囊泡主要由微囊泡(Microvesicles,MVs)和外泌體(Exosomes,Exs)組成，微囊泡是粒检細胞激活、損傷或凋亡後從細胞膜脫落的测媲小囊泡，直徑約為100nm–1000nm。美电外泌體(exosome)是镜的精度简单检测一種由細胞釋放到細胞外基質的膜性小囊泡，直徑約為40-100nm(有說30-150nm，瑞芯目前尚無定論)，智造廣泛存在於細胞培養上清以及各種體液(血液、单颗淋巴液、粒检唾液、测媲尿液、美电精液、镜的精度简单检测乳汁)中，瑞芯攜帶有細胞來源相關的多種蛋白質、脂類、DNA、mRNA、miRNA等，參與細胞間通訊、細胞遷移、血管新生和免疫調節等過程。在糖尿病、心血管疾病、艾滋病、慢性炎症疾病以及癌症中都發現細胞外囊泡水平的升高，它們很有可能成為這類疾病的診斷標誌物。
相比外泌體研究遍地開花的火熱程度(僅國內6月份就有217篇相關論文)，外泌體純化和提取方法可謂是差強人意。目前主流的方法有超速離心(UC)、密度梯度離心(DGC)、免疫捕獲、聚合物沉澱(Precip)、超濾(UF)、排阻色譜(SEC)，以及微流控分析芯片等。往往一種提取方法無法得到足夠純度、濃度的外泌體，每種方法的適用樣品種類也不一樣。
國際細胞外囊泡學會(ISEV)在2014年提議，對於分離獲得的外泌體需要從三個層麵進行鑒定：(1)WesternBlot(WB)鑒定外泌體表麵標誌物;(2)透射電鏡(TEM)鑒定外泌體形態;(3)粒徑分析鑒定外泌體大小。免疫印跡與電鏡觀察耗時長、操作複雜、價格昂貴，在實際研究中難以做到每個外泌體樣本都去做WB與TEM，所以急需一種快速簡便的粒徑分析方法，來作為外泌體鑒定的“先鋒部隊”。
NanocoulterⅠ“芯”方式助力外泌體提取純化研究
NanocoulterⅠ單顆粒檢測，可液體活檢、一個樣本測試僅需5-10分鍾，測試樣本零汙染可回收等特性，恰好貼合該需求，目前已經廣泛應用於細胞外囊泡(外泌體)的提取鑒定工作中。
圖2NanocoulterⅠ外觀
NanocoulterⅠ原理
納米庫爾特原理，測試過程是將待測外泌體分散在電解液中，隨其通過特定孔徑的納米孔芯片，外泌體通過納米孔的一瞬間會占用相同體積電解液的位置，在孔內外兩電極間的電阻(恒電流設計的電路)會發生瞬時變化，產生電位脈衝。脈衝信號的強度和次數與通過納米孔的外泌體顆粒大小及數目成一定比例，直接將脈衝信號進行轉換，即可獲得檢測樣品中外泌體的粒徑和粒子數信息。
圖3NanocoulterⅠ原理圖
圖4NanocoulterⅠ核心技術
NanocoulterⅠ性能參數
檢測的粒度範圍：40nm-2μm
尺寸測定精度：1nm
濃度範圍：1E+06~1E+12個/mL
樣本量：50μL
重複性誤差：<10%
粒徑準確性誤差：<10%
濃度準確性誤差：<20%
外泌體樣本快速檢測粒徑分布、濃度：
隨著研究的深入，更多的分離提取外泌體的方法被開發出來，也有多種提取方法聯用的方式，看似百花齊放，實則良莠不齊，甚至都不盡如人意。NanocoulterⅠ逐個測量外泌體粒徑，得到外泌體的真實粒徑濃度分布，可快速判斷提取方法的優劣。
圖5不同分離提取方法的外泌體粒徑測定
NanocoulterⅠ單顆粒檢測，得到所有顆粒的真實分布狀況，快、準、狠地判別提取方法的優劣性，大大節省了時間和人力成本。
NanocoulterⅠ“快”
測量核心元器件芯片，采用激光刻蝕，納米孔一致性非常高，並且所有對標信息均已裝入檢測卡中的二維碼中，因此儀器無需再次校準、對標等繁瑣測試前步驟，節省了大量寶貴的時間。一卡一碼，掃描二維碼，加入樣本，即可開始測試。並且樣本隻存在於插入式檢測卡樣品槽中，檢測過程中不影響外泌體活性，寶貴的外泌體樣本測試完成後可回收做後續研究。
圖6NanocoulterⅠ檢測卡
NanocoulterⅠ“準”
NanocoulterⅠ的原理決定測得的數據為真實粒徑信息，無需經過反演算或者推導得出，並且配備多種尺寸的已知粒徑和濃度的標準顆粒(60-300nm，20nm一個梯度)來作為基線數據，實現測量數據的定量校準，確保粒徑、濃度數據的絕對準確。無論是不同粒徑的混合樣本，還是有細微差異的同粒徑樣本，均能準確無誤的辨別出來。
圖7不同廠家生產的標準微球的細微差異
NanocoulterⅠ“狠”
NanocoulterⅠ在經典庫爾特原理的基礎上，深耕微納加工技術十餘年，具有原子級別(1納米以下)精度微加工能力，最高分辨率可達1nm。納米孔每通過一個顆粒就產生一個電位脈衝，因此樣本中所有外泌體顆粒均能準確測量，實現真正意義上的的單顆粒檢測。測試過程可直觀的看到外泌體樣本中外泌體顆粒的真實分布情況，測試完成即可立即輸出報告。
圖8外泌體樣本檢測信號脈衝圖
圖9外泌體樣本測試報告
外泌體除開在疾病診斷、載藥等醫學方麵的研究，目前在美容保健等領域也得到了不少的開發與利用，越來越多學者投入外泌體的研究，瑞芯智造(深圳)科技有限公司開發的NanocoulterⅠ納米粒度儀將始終是你研發路上的好夥伴。
全文摘自：瑞芯智造：www.resunbio.com
文中所提到的NanocoulterI單顆粒檢測技術請聯係陶工(13612883919)
參考文獻：
Isolationandcharacterizationofurinaryextracellularvesicles:implicationsforbiomarkerdiscover.NATUREREVIEWS|NEPHROLOGY,10.1038/nrneph.2017.148.
Higherfunctionalityofextracellularvesiclesisolatedusingsize-exclusionchromatographycomparedtoultracentrifugation，Nanomedicine:Nanotechnology,BiologyandMedicine，2017
EvaluationofserumextracellularvesicleisolationmethodsforprofilingmiRNAsbynext-generationsequencing，JournalofExtracellularVesicles，2018.
Comparisonofsmallextracellularvesiclesisolatedfromplasmabyultracentrifugationorsize-exclusionchromatography:yield,purityandfunctionalpotential，JournalofExtracellularVesicles，2019.
